Hekimlikte Elektroforez Kullanımı
T.C.
YÜZÜNCÜ YIL ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
HEKİMLİKTE ELEKTROFOREZ KULLANIMI
Betül APAYDIN
BİYOKİMYA ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS SEMİNERİ
DANIŞMAN
Doç. Dr. Semiha DEDE
VAN- 2006
ELEKTROFOREZ
Elektroforez terimi yunanca “elektron” ve Latince “phore” kelimelerinden oluşmuştur (1). Elektroforez; elektriksel bir alanda yüklü partiküllerin göç etmesidir (2).Elektriksel alan içerisindeki göç; elektrik akımının şiddetine; net yüke; molekülün şekline; solüsyonun iyonik gücüne; viskozitesine ve sıcaklığına bağlıdır. Göç hızı; protein molekülü üzerindeki yükün büyüklüğü ile doğru orantılıdır. İyonik bileşiklerin iyonlaşması; elektroforezin temelini oluşturur. Zıt yükteki elektrotlara doğru farklı hızlarda hareket eden değişik yükteki iyonlar; elektriksel alanda birbirinden ayrılırlar. Elektroforez; ayrılması istenen iyonları ihtiva eden bir çözelti ile kağıt; nişasta agar; selüloz asetat zarı gibi inert bir taşıyıcı materyalin teşkil ettiği bir sistemde yapılabilir (3–5).
Elektriksel alandaki hareket hızlarına ve yönlerine bakılarak moleküller birbirinden ayrılabilir. Pozitif yük taşıyan moleküller; negatif yüklü kutup olan katoda ilerledikleri için katyon; negatif yüklüler ise pozitif yüklü kutup anoda ilerledikleri için anyon olarak adlandırılırlar. Bir molekülün elektriksel mobilitesini etkileyen faktörler vardır:
1. Molekülün net elektriksel yükü
2. Molekülün şekil ve büyüklüğü
3. Elektriksel alanın gücü
4. Yürütme ortamının özellikleri (por genişliği; pH)
5. Yürütmenin yapıldığı sıcaklık
Molekülün net elektriksel yükü; uygulanan elektriksel alan şiddeti; yürütmenin yapıldığı sıcaklığın artması gibi etkenler elektriksel mobiliteyi arttırırken; iyon büyüklüğü ve destek ortamının viskozitesi mobiliteyi azaltır. Yani;
µ= Q/krŋ
µ= Elektriksel mobilite
Q= Molekülün net yükü
k= Sabit değer
ŋ= Yürütme ortamının viskozitesi
Elektroforez; proteinlerin; izoenzimlerin ve lipoproteinlerin ayrılmasında kullanılır. Elektroforetik yöntemlerle serum; idrar; BOS (beyin omurilik sıvısı) veya diğer vücut mayileri; eritrosit ve doku proteinleri analiz edilebilir (6).
Elektroforez fikri ilk kez 1809’da Reuss (7) tarafından öne sürülmüş; 1937’de Tiselius (8); belirli bir pH derecesinde protein fraksiyonlarının taşıdıkları elektriksel yüklere göre değişik hızda hareket ettiklerini göstermiş ve plazma proteinlerinin bu yolla sınıflandırılabileceğini bildirmiştir. İlk elektroforetik seperasyonlar; genellikle solüsyon içindeki iyonların serbest hareketleriyle yapılmaktaydı. Sınır elektroforezi denilen bu yöntemde; hareket eden iyonlar bir sınır teşkil ederler ve bu sınır; solüsyon boyunca kırılma sayısında meydana gelen değişmeler ölçülerek tayin edilebilirdi (2). Daha sonraki dönemlerde destek ortamının kullanıldığı zone (bölge) elektroforez yöntemleri geliştirilmiştir. 1950’de kağıt elektroforezi kullanılarak proteinler ayrılmış (9); 1955’te Smithies (10) nişasta jel elektroforezi yöntemini geliştirmiştir. Nişasta jel elektroforezi diğer zone elektroforez yöntemlerine göre üstün çözme gücüne sahiptir. Poliakrilamid jelinin elektroforezde kullanılması; Raymond ve ark. (11) tarafından başarılmıştır. Destek ortam olarak agaroz jelin kullanılması Akselsen ve ark. (12); sellüloz asetatın kullanılması Kohn (13) tarafından geliştirilmiştir (14).
Destek ortamı olarak filtre kağıdı; sellüloz asetat kağıdı; nişasta ve poliakrilamid jelleri kullanılmaktadır.
Elektroforezde kullanılan tamponlar pH’ı sabit tutarlar; elektrik akımını iletirler ve moleküllerin tek yönde göç etmelerini sağlarlar. Elektroforezde kullanılan tamponlar: genelde format; asetat; fosfat; tris; EDTA ve pridindir. Tampon ayrılacak bileşenlere bağlanmamalıdır. Bağlanma göç hızını etkiler. Ancak bazı durumlarda bağlanma istenebilir. Örneğin borat tamponu karbonhidrat ayrılmasında yüklü kompleks oluşturduğu için kullanılır. Tamponların çözücü olarak etki etmeleri nedeniyle; aminoasit ve şekerler gibi küçük moleküllerde difüzyon görülebilir. Tamponların iyonik kuvveti göçü etkileyeceği için genellikle 0;05–0;10 M derişimde ve her ayırma için uygun pH’ta olmalıdır (14).
Molekülün biçiminin ve büyüklüğünün özgül ayrıntılarını tanımlamak uygun değildir. Elektroforez; moleküllerin tanınması ve saflaştırma analizi için uygulanır. Bir karışımdaki her molekülün tek bir yüke ve büyüklüğe sahip olması beklendiği için; elektriksel alanda mobilite de tek olacaktır. Bu beklenti; tüm elektroforetik metotlarda ayrışma ve analiz için temel esastır (15). Buna dayanarak; özellikle aminoasitlerin; karbonhidratların; peptidlerin; proteinlerin; nükleotidlerin ve nükleik asitlerin elektroforetik analizi yapılır (16).
ELEKTROFOREZ ÇEŞİTLERİ
Kullanılan ayırma ortamının cinsine göre çeşitli elektroforez teknikleri kullanılmaktadır. Kağıt elektroforezi; selüloz asetat elektroforezi; agaroz jel elektroforezi; nişasta jel elektroforezi; poliakrilamid jel elektroforezi ve kapillar elektroforez bunlar arasında sayılmaktadır (17-20).
Kağıt Elektroforez Sistemi
Hem rutin hem de araştırma maksatlı destek ortamı olarak kaliteli filtre kağıdı kullanılan elektroforez çeşididir. Metodun avantajı; ucuz ve yüksek gerilime dayanabilmesidir. Ancak; deney süresi uzun (16–18 saat) olduğundan rutinde pek kullanılmaz. Özellikle aminoasitlerin ayrımında kullanılır (14).
Bu yöntemde protein çözeltisinden; örneğin serumdan; çok az bir miktar (0;5–10µl); bir çizgi boyunca dar bir süzgeç kağıdı şeridine sürülür. Süzgeç kağıdının uçları; birbiri ile iştirak halinde olmayan ve içlerine tampon çözeltisi konmuş iki tank içine batırılır. Tanklara daldırılmış elektrotlardan sabit voltajda doğru akım verilir. Örneğin; pH 8;6’lık bir veronal tampon çözeltisi kullanılarak 120 voltluk akımla; 18 saat kadar sonra; serum proteinleri tatbik edilmiş elektroforez şeritleri kurutulup boyanacak olursa genellikle beş fraksiyonun (serum albümin; α1; α2; β ve γ globülinler) ayrıldığı görülür. Kağıt elektroforezinde proteinler için Amidoschwartz; lipidler için Sudan Schwartz B (Sudan IV) boya maddesi kullanılır (21).
a γ β α2 α1 Serum albümini
__________________________________
Serum Uygulanan Çizgi
Globülinler
Şekil 1. Kağıt Elektroforezi ile Serum Proteinlerinin Ayrıldığı Fraksiyonların Şematik Görünümü (21).
Sellüloz Asetat Elektroforezi
Selülozun hidroksil grupları asetik asit anhidr ile reaksiyona sokularak elde edilen sellüloz asetat plaklarının kullanıldığı elektroforez çeşididir. Sellüloz asetat elektroforezi genellikle protein elektroforezi için kullanılır. Pahalı olmaması; soğutma cihazı veya güç kaynağına ihtiyaç duyulmaması; ayırımın hızlı olması ve az miktardaki maddelerin de ayrımının yapılabilmesi; proteinleri minimum düzeyde absorbe etmesi gibi avantajlara sahiptir. Opak olması ve dansitometreden önce kısmen arıtılması için kimyasal işlemlere ihtiyaç göstermesi gibi dezavantajlara sahiptir. Ayrıca porları küçük olduğundan; büyük moleküllü proteinler elektroforeze tabi tutuldukları zaman bu tip elektroforezin kullanımı sınırlıdır (2; 22; 23).
Gerekli ayıraçlar hazırlanır. Sellüloz asetat şerit tamponda ıslatılır ve sonra alınarak hafifçe kurutulur. Elektroforez tankı kurulur; soğuk tampon bölümlere dökülür. Sellüloz asetat şeridi bölümlere yerleştirilir; numune aplikatör ile sellüloz asetata uygulanır. Tankın kapağı kapatılarak; 250–300 voltta 35–40 dakika bekletilir. Yatay tutulup boya solüsyonundan geçirilir. Kurutularak dansitometrede taranır (24).
Serum proteinlerinin elektroforezinde anoda en hızlı göçen fraksiyon; prealbümin ve albümindir; en yavaş göçen fraksiyon g-globülin fraksiyonudur. Prealbümin fraksiyonu rutin serum proteinleri elektroforezinde fark edilmez.
Şekil 2. Selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları (21).
Agaroz Jel Elektroforezi
Destek maddesi olarak agarın kullanıldığı elektroforez çeşididir. Serum proteinlerinin; hemoglobin varyantlarının; laktat dehidrogenaz izoenzimlerinin; lipoprotein fraksiyonlarının analizinde başarılı bir şekilde kullanılmaktadır (21).
Destek maddesi olarak bir karbonhidrat türevi olan agaroz veya agaropektin kullanılır. Bu maddelerin proteinlere affinitesi az olduğundan protein bantları birbirinden iyi ayrılır. Ayrıca çok iyi şeffaflaştıklarından dansitometrik değerlendirilmeleri daha güvenilirdir. Bu yüzden rutin uygulamalarda sıkça kullanılmaktadır. Bu teknikte uygulama süresi oldukça kısadır (30–90 dakika) (14).
Protein seperasyonunda sıkça kullanılan bu tekniğin üstünlüğü; ortamın proteinleri oldukça düşük oranda absorbe etmesi ve dansitometreye daha net bantlar sunmasıdır. Başka bir avantajı da çok sayıda proteinler üzerine çalışma imkanı vermesi ve çalışma tekniğinin kolay olmasıdır. Jelden proteinlerin yeniden elde edilmesi de oldukça iyidir (22).
Por büyüklüğü kullanılan agar konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir. Lipoprotein ve nükleik asitler gibi büyük moleküllerin ayrılması amacıyla büyük por hacmi gereklidir. Ayrıca agaroz immunoelektroforezde de kullanılır. Antikorlar jel dökülmeden önce ilave edildiği gibi; elektroforez tamamlandıktan sonra antikorun jel içine diffuze olabilmesi için de bırakılabilir. Agaroz ile voltaja bağlı olarak elde edilen rezolüsyon; sellüloz asetatta elde edilenden daha iyidir. Yüksek voltajlı elektroforez sırasında soğutma işlemi gereklidir. Bu nedenle kullanılan aletler selüloz asetat elektroforezinden daha pahalıdır. Ayrıca agaroz kolayca kırılabildiği için dikkatle çalışılmalıdır (22; 23).
Nişasta Jel Elektroforezi
Destek ortamı olarak nişasta jeli kullanılır (14). İlk defa Smithies (25) kullanmış; elektroforetik ayrılmada numunenin elektrostatik yüklerinin önemi olduğunu vurgulayarak; jelin gözeneklere sahip olmasının seperasyonda kolaylık olduğunu belirtmiştir. Bu özellik küçük moleküllerin büyük molekülleri jel ortamında kolaylıkla geçmesini sağlayarak; hareketin elektriksel yüke olduğu kadar molekül büyüklüğüne de bağlı olduğunu göstermektedir (25-27). Nişasta jeli elektroforezi çok iyi ayırma sağladığından hem rutin hem de araştırma maksatları için kullanılır (14).
Nişasta hidrolize edilerek nişasta jeli hazırlanır. Numune nişasta jeline yerleştirilir. Jel plaka elektrot üzerine yerleştirilir. Kapak kapatılarak 310 voltta 13-14 saat bekletilir. Elektroforetik göç 17 cm oluncaya kadar elektroforez işlemine devam edilir. İşlem tamamlandıktan sonra jeldeki numunelerin yerleştirildiği kısım kesilerek uzaklaştırılır. Plastik kaba alınarak boya solüsyonu tatbik edilir. 37°C’de 5-6 saat etüvde bekletilir. Jel yıkama solüsyonundan geçirilerek bantlar görünür hale gelir.
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Poliakrilamidin bir bağlayıcı (genellikle bis akrilamid) ile polimerize edilmesi sonucu oluşturulur. Böylece rasgele büyüyen poliakrilamid ve bis akrilamid konsantrasyonları oluşacak jelin yoğunluğunu; viskozitesini; elastikiyetini ve mekanik dağınıklığını belirler (19).
Elektroforezde durgun fazı; örneğin üzerine uygulandığı kağıt yada sentetik jeller oluşturur. Hareketli faz ise elektrik akımıdır. Elektrik akımı; elektrolit bir tampon çözelti yardımıyla uygulanır. Seçilen pH değerine göre aynı özellikteki biyomoleküllerin iyonizasyonu benzer olacağından yürüme yalnızca bir kutuba doğru oluşur. Böylece ayrışma jel elemesinde olduğu gibi molekül büyüklüğü ve üç boyutlu yapıya göredir. Yürümeyi yük/kütle oranı doğrudan etkiler. Küçük moleküller önde; büyükler ise geride olacak şekilde sıralama oluşur.
SDS PAGE
Poliakrilamid jel elektroforezi: SDS PAGE (denatüre edici page) ve ND-PAGE (non denatüre edici page) olarak ikiye ayrılır. ND-PAGE( non denatüre edici page ); proteinlerin doğal (intakt) yapılarını bozucu ajanlar kullanmadan yapılan PAGE yöntemidir. SDS PAGE (denatüre edici page); SDS (Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptid zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri birbirinden ayırır. Jel konsantrasyonu arttırılarak; protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır. SDS PAGE yöntemi proteinlerin saflığının kontrolü; molekül ağırlıklarının saptanması ve konsantrasyon çeşitliliğinin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır. Proteinler için çok uygun olduğu gibi DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir. Akrilamid miktarı ve akrilamid/bisakrilamid oranı jelin ayrıştırma kapasitesini belirler (28; 29).
Şekil 3. Agaroz jel elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları.
Kapiller Elektroforez
Kapillar elektroforez; elektriksel alanda moleküllerin hareketine dayanan ayırım metotlarının en yenisidir. Bu teknik hızlı; duyarlı ve otomatik olarak kullanılabildiğinden çalışılan birçok protein ve polipeptidin tamamen ayrılabilmesi mümkün olmaktadır. Bu tip elektroforezin avantajları; yüksek voltajın kullanılabilmesi; ısı transferinin mümkün olması ile hızlı seperasyon; yüksek rezolüsyon; çok küçük numune hacmi gereksinimi ve işlem sırasında proteinin denatüre olmamasıdır. Dezavantajı ise proteinlerin tayini; miktarlarının saptanmasının güç olması ve proteinlerin kolona adsorbe olabilmesidir (23; 30).
2–200 µm (mikron) çapta ve 10–100 cm kadar uzunluktaki kapiller bir boru; bu borunun iki ucunda iki tampon haznesi; bu tampon haznelerinin birisine (+) birisine (-) kutbu bağlı olan bir güç kaynağı ve kapillerin bir ucunda mevcut bir dedektörden oluşur. Güç kaynağının iki kutbu arasındaki bağlantıyı kapiller borunun içini dolduran tampon sağlamaktadır (14; 22). Tampon katodun yönünde akar. Tampondaki anyonlar tampona karşı akışla anota gider. Numune katoda konulur. Kapilların iki ucu tampon içeren elektroforez hücrelerine daldırılır. Kapillar jel veya amfolit solüsyonları da içerebilir.
İmmunoelektroforez
Bazen jel üzerinde birbirinden ayrılmış proteinler; antikorlar adı verilen immunoglobülinlerle etkileşerek antijenik durumları hakkında bilgi sahibi olunur. Antijen-antikor reaksiyonu ile elektroforez yöntemini birlikte içeren bir tekniktir.
Serum proteinleri önce elektroforeze uğratılır; sonra bir jel ortamında antiserum ile karşılıklı diffüzyonu sağlanır. Oluşan antijen-antikor reaksiyonları sonucunda oluşan presipitasyonlar kavisler halinde belirir. Serum ve plazmada sayısı 150’den fazla olan proteinlerin 70 kadarını bu yöntemle ayırmak mümkün olmuştur (14; 21).
SERUM PROTEİNLERİ
Normal bir serum protein elektroforezi sonucunda; albümin; α1; α2; β ve γ-globülinden oluşmuş 5 temel fraksiyon elde edilmiştir (şekil 4). Sellüloz asetat elektroforezi ile elde edilen bu bantların sayısı hayvan türlerine göre değişir.
Şekil 4. Selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein bantları (31).
Bu bantların bileşimleri şöyledir;
α1- asit glikoprotein
α1-lipoprotein
α1-fetoprotein
Haptoglobülin
Serüloplazmin
4. Beta globülinler
β- lipoprotein
Transferrin
Kompleman proteinleri
β2- mikroglobülin
Hemopeksin
5. γ-globülinler (İmmunoglobülinler)
Ig A; Ig M; Ig G; Ig D; Ig
1. a) Prealbümin
Prealbümin; karaciğerde sentezlenir. Prealbümin molekülü üzerinde retinol bağlayan proteini bağlayacak yerler ve tiroksin bağlayabilecek bir yer bulunur. Oral kontraseptif kullananlarda; gebelerde; inflamatuar olaylarda; malign tümörlerde; malnütrisyonda; karaciğer hastalıklarında serum prealbümin düzeyi azalır (31).
1. b) Albümin
Serum albümin; karaciğerde sentezlenir. Renksiz; şekilsiz ve yumurta akı albüminine çok yakın bir maddedir. Serum albüminin önemli işlevleri vardır:
a) Bilirubin; uzun zincirli yağ asitleri; T3; T4; kortizol; aldosteron; Ca2+; Cu2+ ve bazı ilaçları taşır.
b) Endojen aminoasit deposu olarak görev görür.
c) Plazma onkotik basıncının devamlılığını sağlar.
d) Kanın viskozitesini etkiler. Serum albümin düzeyinin normal sınırlardan düşük olması hipoalbüminemiolarak tanımlanır. Serum albümin düzeyi 2;0 g/ dl’nin altına düştüğünde ödem gelişir (31).
2. a1-Globülin
a1-globülin fraksiyonunun önemli proteinleri:
● a1- antitripsin
● a1- antikimotripsin
● a1-asit glikoprotein (orosomukoid)
● a- fetoprotein (AFP)
a1-antitripsin; karaciğer parankim hücreleri; mononüklear seri hücreler ve alveoler makrofajlarda sentezlenir. Nadir olarak görülen kalıtımsal a1-antitripsin eksikliği; klinik olarak amfizem ve neonatal kolestatik sarılık ile karakterizedir. Alfa fetoprotein (AFP); fötusun ana proteinidir; karaciğerde sentezlenir. Hepatosellüler karsinom ve diğer karaciğer hastalıklarında; gebelikte; testis ve ovaryum kanserlerinde; mide kanserinde serum alfa fetoprotein (AFP) düzeyi artar.
3. a2-Globülin
a1 ve a2-globülinler arasında göç eden başlıca serum proteinleri; tiroksin bağlayan globülin ve seruloplazmindir. a2-globülin fraksiyonunun önemli proteinleri a2-makroglobülinve haptoglobindir. Tiroksin bağlayan globülin;bir glikoproteindir; tiroid hormonları olan T3 ve T4 için temel taşıyıcıdır. Seruloplazmin;daha çok a2-globülin fraksiyonunda gözlenen; %10 civarında karbonhidrat içeren bir bakırlı proteindir. Wilson hastalığında ve malnütrisyonda serum seruloplazmin düzeyi azalır. a2-makroglobülin; a2-globülin fraksiyonunun büyük çoğunluğunu oluşturur. a2-makroglobülin; plazmanın en önemli proteaz inhibitörlerinden biridir. Haptoglobin; karaciğerde sentezlenen ve eritrosit dışındaki serbest hemoglobini bağlayan plazma glikoproteinidir (31).
4. b-Globülin
b-globülin fraksiyonunun önemli proteinleri; hemopeksin ve transferrin (siderofilin)’dir (31).
5. g-GLOBÜLİN
g-globülin fraksiyonunun önemli proteinleri; immunoglobülinler (antikorlar); sistem proteini ve C-reaktif protein (CRP)’dir (31).
ELEKTROFOREZ KULLANIM ALANLARI
Elektroforez; proteinleri ayırmada kullanılan bir teknik olup serum; plazma; idrar; gözyaşı; dışkı; eklem sıvısı gibi organik ürünlere uygulanabilir. Kullanıldığı başlıca yerler;
Normalde bulunmayan bantların görünür hale gelmesi ise değişik klinik durumlarda gözlenmektedir. Albümin ile a1 bandı arasında belirecek soluk bir bant; bazı kötü huylu tümörlerde serumda artan a- fetoproteine bağlıdır. Monositer lösemilerde lizozim düzeyinin artışı γ bölgesinden ileride bir bant oluşturmaktadır. Protein kaybedilen nefropatilerde albümin; a1; β ve γ- globülinlerde azalma görülür (32).
Aktif hemoliz sonucu haptoglobülin eksikliği olan kişilerde a2 veya β bölgelerine göçen bağımsız bir hemoglobin bandı izlenmektedir. Demir eksikliği olgularında transferin artışına bağlı belirgin β bandı izlenmektedir. Bu yüzden myeloma bandı ile karışabilmektedir (32).
Karaciğer sirozu olgularında albümin sentezinin azalması ve kaybının artması sonucu serum konsantrasyonu azalmaktadır. Albümindeki azalma γ fraksiyonundaki immunglobülinlerin artışı ile dengelenmektedir. Tüm immunglobülinleri kapsayan γ globülin fraksiyonundaki artma ve yavaş β bölgesine uzanan IgA artışı; β-γ köprüleşmesi olarak adlandırılmaktadır (32).
Hipogamaglobülinemi γ bandının tamamına yakın veya tamamının yokluğudur. Lenforetiküler bozukluklarda ve kanser tedavisi için kemoterapi uygulanan vakalarda ve yeni doğanlarda rastlanır (32).
Akut ve kronik karaciğer hastalıkları; kronik enfeksiyonlar; akut diffüz glomerülonefrit; sarkoidoz; karsinom ve otoimmün hastalıklarda serum g-globülin fraksiyonu artar. Nefrotik sendrom; ağır malabsorpsiyon ve malnütrisyon; primer immun yetmezlik ve sekonder immun yetmezlik durumlarında serum g-globülin fraksiyonu azalır (31).
Şekil 5. Akut ve kronik inflamasyon durumunda selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları (31).
Karaciğer hastalıklarında özellikle β-globülin fraksiyonunda belirgin bir artış gözlenir. Sirozda serum albümin düşer; serum γ-globülin artışı hafiftir; a-globülin ve β-globülin konsantrasyonları serum lipoproteinindeki artışa bağlı olarak yükselmiştir (33).
Şekil 6. Siroz durumunda selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları (31).
Karaciğer paranşimal sentez
YÜZÜNCÜ YIL ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
HEKİMLİKTE ELEKTROFOREZ KULLANIMI
Betül APAYDIN
BİYOKİMYA ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS SEMİNERİ
DANIŞMAN
Doç. Dr. Semiha DEDE
VAN- 2006
ELEKTROFOREZ
Elektroforez terimi yunanca “elektron” ve Latince “phore” kelimelerinden oluşmuştur (1). Elektroforez; elektriksel bir alanda yüklü partiküllerin göç etmesidir (2).Elektriksel alan içerisindeki göç; elektrik akımının şiddetine; net yüke; molekülün şekline; solüsyonun iyonik gücüne; viskozitesine ve sıcaklığına bağlıdır. Göç hızı; protein molekülü üzerindeki yükün büyüklüğü ile doğru orantılıdır. İyonik bileşiklerin iyonlaşması; elektroforezin temelini oluşturur. Zıt yükteki elektrotlara doğru farklı hızlarda hareket eden değişik yükteki iyonlar; elektriksel alanda birbirinden ayrılırlar. Elektroforez; ayrılması istenen iyonları ihtiva eden bir çözelti ile kağıt; nişasta agar; selüloz asetat zarı gibi inert bir taşıyıcı materyalin teşkil ettiği bir sistemde yapılabilir (3–5).
Elektriksel alandaki hareket hızlarına ve yönlerine bakılarak moleküller birbirinden ayrılabilir. Pozitif yük taşıyan moleküller; negatif yüklü kutup olan katoda ilerledikleri için katyon; negatif yüklüler ise pozitif yüklü kutup anoda ilerledikleri için anyon olarak adlandırılırlar. Bir molekülün elektriksel mobilitesini etkileyen faktörler vardır:
1. Molekülün net elektriksel yükü
2. Molekülün şekil ve büyüklüğü
3. Elektriksel alanın gücü
4. Yürütme ortamının özellikleri (por genişliği; pH)
5. Yürütmenin yapıldığı sıcaklık
Molekülün net elektriksel yükü; uygulanan elektriksel alan şiddeti; yürütmenin yapıldığı sıcaklığın artması gibi etkenler elektriksel mobiliteyi arttırırken; iyon büyüklüğü ve destek ortamının viskozitesi mobiliteyi azaltır. Yani;
µ= Q/krŋ
µ= Elektriksel mobilite
Q= Molekülün net yükü
k= Sabit değer
ŋ= Yürütme ortamının viskozitesi
Elektroforez; proteinlerin; izoenzimlerin ve lipoproteinlerin ayrılmasında kullanılır. Elektroforetik yöntemlerle serum; idrar; BOS (beyin omurilik sıvısı) veya diğer vücut mayileri; eritrosit ve doku proteinleri analiz edilebilir (6).
Elektroforez fikri ilk kez 1809’da Reuss (7) tarafından öne sürülmüş; 1937’de Tiselius (8); belirli bir pH derecesinde protein fraksiyonlarının taşıdıkları elektriksel yüklere göre değişik hızda hareket ettiklerini göstermiş ve plazma proteinlerinin bu yolla sınıflandırılabileceğini bildirmiştir. İlk elektroforetik seperasyonlar; genellikle solüsyon içindeki iyonların serbest hareketleriyle yapılmaktaydı. Sınır elektroforezi denilen bu yöntemde; hareket eden iyonlar bir sınır teşkil ederler ve bu sınır; solüsyon boyunca kırılma sayısında meydana gelen değişmeler ölçülerek tayin edilebilirdi (2). Daha sonraki dönemlerde destek ortamının kullanıldığı zone (bölge) elektroforez yöntemleri geliştirilmiştir. 1950’de kağıt elektroforezi kullanılarak proteinler ayrılmış (9); 1955’te Smithies (10) nişasta jel elektroforezi yöntemini geliştirmiştir. Nişasta jel elektroforezi diğer zone elektroforez yöntemlerine göre üstün çözme gücüne sahiptir. Poliakrilamid jelinin elektroforezde kullanılması; Raymond ve ark. (11) tarafından başarılmıştır. Destek ortam olarak agaroz jelin kullanılması Akselsen ve ark. (12); sellüloz asetatın kullanılması Kohn (13) tarafından geliştirilmiştir (14).
Destek ortamı olarak filtre kağıdı; sellüloz asetat kağıdı; nişasta ve poliakrilamid jelleri kullanılmaktadır.
Elektroforezde kullanılan tamponlar pH’ı sabit tutarlar; elektrik akımını iletirler ve moleküllerin tek yönde göç etmelerini sağlarlar. Elektroforezde kullanılan tamponlar: genelde format; asetat; fosfat; tris; EDTA ve pridindir. Tampon ayrılacak bileşenlere bağlanmamalıdır. Bağlanma göç hızını etkiler. Ancak bazı durumlarda bağlanma istenebilir. Örneğin borat tamponu karbonhidrat ayrılmasında yüklü kompleks oluşturduğu için kullanılır. Tamponların çözücü olarak etki etmeleri nedeniyle; aminoasit ve şekerler gibi küçük moleküllerde difüzyon görülebilir. Tamponların iyonik kuvveti göçü etkileyeceği için genellikle 0;05–0;10 M derişimde ve her ayırma için uygun pH’ta olmalıdır (14).
Molekülün biçiminin ve büyüklüğünün özgül ayrıntılarını tanımlamak uygun değildir. Elektroforez; moleküllerin tanınması ve saflaştırma analizi için uygulanır. Bir karışımdaki her molekülün tek bir yüke ve büyüklüğe sahip olması beklendiği için; elektriksel alanda mobilite de tek olacaktır. Bu beklenti; tüm elektroforetik metotlarda ayrışma ve analiz için temel esastır (15). Buna dayanarak; özellikle aminoasitlerin; karbonhidratların; peptidlerin; proteinlerin; nükleotidlerin ve nükleik asitlerin elektroforetik analizi yapılır (16).
ELEKTROFOREZ ÇEŞİTLERİ
Kullanılan ayırma ortamının cinsine göre çeşitli elektroforez teknikleri kullanılmaktadır. Kağıt elektroforezi; selüloz asetat elektroforezi; agaroz jel elektroforezi; nişasta jel elektroforezi; poliakrilamid jel elektroforezi ve kapillar elektroforez bunlar arasında sayılmaktadır (17-20).
Kağıt Elektroforez Sistemi
Hem rutin hem de araştırma maksatlı destek ortamı olarak kaliteli filtre kağıdı kullanılan elektroforez çeşididir. Metodun avantajı; ucuz ve yüksek gerilime dayanabilmesidir. Ancak; deney süresi uzun (16–18 saat) olduğundan rutinde pek kullanılmaz. Özellikle aminoasitlerin ayrımında kullanılır (14).
Bu yöntemde protein çözeltisinden; örneğin serumdan; çok az bir miktar (0;5–10µl); bir çizgi boyunca dar bir süzgeç kağıdı şeridine sürülür. Süzgeç kağıdının uçları; birbiri ile iştirak halinde olmayan ve içlerine tampon çözeltisi konmuş iki tank içine batırılır. Tanklara daldırılmış elektrotlardan sabit voltajda doğru akım verilir. Örneğin; pH 8;6’lık bir veronal tampon çözeltisi kullanılarak 120 voltluk akımla; 18 saat kadar sonra; serum proteinleri tatbik edilmiş elektroforez şeritleri kurutulup boyanacak olursa genellikle beş fraksiyonun (serum albümin; α1; α2; β ve γ globülinler) ayrıldığı görülür. Kağıt elektroforezinde proteinler için Amidoschwartz; lipidler için Sudan Schwartz B (Sudan IV) boya maddesi kullanılır (21).
a γ β α2 α1 Serum albümini
__________________________________
Serum Uygulanan Çizgi
Globülinler
Şekil 1. Kağıt Elektroforezi ile Serum Proteinlerinin Ayrıldığı Fraksiyonların Şematik Görünümü (21).
Sellüloz Asetat Elektroforezi
Selülozun hidroksil grupları asetik asit anhidr ile reaksiyona sokularak elde edilen sellüloz asetat plaklarının kullanıldığı elektroforez çeşididir. Sellüloz asetat elektroforezi genellikle protein elektroforezi için kullanılır. Pahalı olmaması; soğutma cihazı veya güç kaynağına ihtiyaç duyulmaması; ayırımın hızlı olması ve az miktardaki maddelerin de ayrımının yapılabilmesi; proteinleri minimum düzeyde absorbe etmesi gibi avantajlara sahiptir. Opak olması ve dansitometreden önce kısmen arıtılması için kimyasal işlemlere ihtiyaç göstermesi gibi dezavantajlara sahiptir. Ayrıca porları küçük olduğundan; büyük moleküllü proteinler elektroforeze tabi tutuldukları zaman bu tip elektroforezin kullanımı sınırlıdır (2; 22; 23).
Gerekli ayıraçlar hazırlanır. Sellüloz asetat şerit tamponda ıslatılır ve sonra alınarak hafifçe kurutulur. Elektroforez tankı kurulur; soğuk tampon bölümlere dökülür. Sellüloz asetat şeridi bölümlere yerleştirilir; numune aplikatör ile sellüloz asetata uygulanır. Tankın kapağı kapatılarak; 250–300 voltta 35–40 dakika bekletilir. Yatay tutulup boya solüsyonundan geçirilir. Kurutularak dansitometrede taranır (24).
Serum proteinlerinin elektroforezinde anoda en hızlı göçen fraksiyon; prealbümin ve albümindir; en yavaş göçen fraksiyon g-globülin fraksiyonudur. Prealbümin fraksiyonu rutin serum proteinleri elektroforezinde fark edilmez.
Şekil 2. Selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları (21).
Agaroz Jel Elektroforezi
Destek maddesi olarak agarın kullanıldığı elektroforez çeşididir. Serum proteinlerinin; hemoglobin varyantlarının; laktat dehidrogenaz izoenzimlerinin; lipoprotein fraksiyonlarının analizinde başarılı bir şekilde kullanılmaktadır (21).
Destek maddesi olarak bir karbonhidrat türevi olan agaroz veya agaropektin kullanılır. Bu maddelerin proteinlere affinitesi az olduğundan protein bantları birbirinden iyi ayrılır. Ayrıca çok iyi şeffaflaştıklarından dansitometrik değerlendirilmeleri daha güvenilirdir. Bu yüzden rutin uygulamalarda sıkça kullanılmaktadır. Bu teknikte uygulama süresi oldukça kısadır (30–90 dakika) (14).
Protein seperasyonunda sıkça kullanılan bu tekniğin üstünlüğü; ortamın proteinleri oldukça düşük oranda absorbe etmesi ve dansitometreye daha net bantlar sunmasıdır. Başka bir avantajı da çok sayıda proteinler üzerine çalışma imkanı vermesi ve çalışma tekniğinin kolay olmasıdır. Jelden proteinlerin yeniden elde edilmesi de oldukça iyidir (22).
Por büyüklüğü kullanılan agar konsantrasyonuna bağlı olarak değişebilir. Lipoprotein ve nükleik asitler gibi büyük moleküllerin ayrılması amacıyla büyük por hacmi gereklidir. Ayrıca agaroz immunoelektroforezde de kullanılır. Antikorlar jel dökülmeden önce ilave edildiği gibi; elektroforez tamamlandıktan sonra antikorun jel içine diffuze olabilmesi için de bırakılabilir. Agaroz ile voltaja bağlı olarak elde edilen rezolüsyon; sellüloz asetatta elde edilenden daha iyidir. Yüksek voltajlı elektroforez sırasında soğutma işlemi gereklidir. Bu nedenle kullanılan aletler selüloz asetat elektroforezinden daha pahalıdır. Ayrıca agaroz kolayca kırılabildiği için dikkatle çalışılmalıdır (22; 23).
Nişasta Jel Elektroforezi
Destek ortamı olarak nişasta jeli kullanılır (14). İlk defa Smithies (25) kullanmış; elektroforetik ayrılmada numunenin elektrostatik yüklerinin önemi olduğunu vurgulayarak; jelin gözeneklere sahip olmasının seperasyonda kolaylık olduğunu belirtmiştir. Bu özellik küçük moleküllerin büyük molekülleri jel ortamında kolaylıkla geçmesini sağlayarak; hareketin elektriksel yüke olduğu kadar molekül büyüklüğüne de bağlı olduğunu göstermektedir (25-27). Nişasta jeli elektroforezi çok iyi ayırma sağladığından hem rutin hem de araştırma maksatları için kullanılır (14).
Nişasta hidrolize edilerek nişasta jeli hazırlanır. Numune nişasta jeline yerleştirilir. Jel plaka elektrot üzerine yerleştirilir. Kapak kapatılarak 310 voltta 13-14 saat bekletilir. Elektroforetik göç 17 cm oluncaya kadar elektroforez işlemine devam edilir. İşlem tamamlandıktan sonra jeldeki numunelerin yerleştirildiği kısım kesilerek uzaklaştırılır. Plastik kaba alınarak boya solüsyonu tatbik edilir. 37°C’de 5-6 saat etüvde bekletilir. Jel yıkama solüsyonundan geçirilerek bantlar görünür hale gelir.
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
Poliakrilamidin bir bağlayıcı (genellikle bis akrilamid) ile polimerize edilmesi sonucu oluşturulur. Böylece rasgele büyüyen poliakrilamid ve bis akrilamid konsantrasyonları oluşacak jelin yoğunluğunu; viskozitesini; elastikiyetini ve mekanik dağınıklığını belirler (19).
Elektroforezde durgun fazı; örneğin üzerine uygulandığı kağıt yada sentetik jeller oluşturur. Hareketli faz ise elektrik akımıdır. Elektrik akımı; elektrolit bir tampon çözelti yardımıyla uygulanır. Seçilen pH değerine göre aynı özellikteki biyomoleküllerin iyonizasyonu benzer olacağından yürüme yalnızca bir kutuba doğru oluşur. Böylece ayrışma jel elemesinde olduğu gibi molekül büyüklüğü ve üç boyutlu yapıya göredir. Yürümeyi yük/kütle oranı doğrudan etkiler. Küçük moleküller önde; büyükler ise geride olacak şekilde sıralama oluşur.
SDS PAGE
Poliakrilamid jel elektroforezi: SDS PAGE (denatüre edici page) ve ND-PAGE (non denatüre edici page) olarak ikiye ayrılır. ND-PAGE( non denatüre edici page ); proteinlerin doğal (intakt) yapılarını bozucu ajanlar kullanmadan yapılan PAGE yöntemidir. SDS PAGE (denatüre edici page); SDS (Sodyum dodesil sülfat) anyonik bir deterjan olup iki amino asitte bir peptid zincirine bağlanarak protein moleküllerini oluşturan alt birimleri birbirinden ayırır. Jel konsantrasyonu arttırılarak; protein moleküllerinin molekül ağırlıklarına göre ayrışmaları sağlanır. SDS PAGE yöntemi proteinlerin saflığının kontrolü; molekül ağırlıklarının saptanması ve konsantrasyon çeşitliliğinin belirlenmesi amacıyla kullanılmaktadır. Proteinler için çok uygun olduğu gibi DNA ve RNA elektroforezleri için de kullanılabilir. Akrilamid miktarı ve akrilamid/bisakrilamid oranı jelin ayrıştırma kapasitesini belirler (28; 29).
Şekil 3. Agaroz jel elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları.
Kapiller Elektroforez
Kapillar elektroforez; elektriksel alanda moleküllerin hareketine dayanan ayırım metotlarının en yenisidir. Bu teknik hızlı; duyarlı ve otomatik olarak kullanılabildiğinden çalışılan birçok protein ve polipeptidin tamamen ayrılabilmesi mümkün olmaktadır. Bu tip elektroforezin avantajları; yüksek voltajın kullanılabilmesi; ısı transferinin mümkün olması ile hızlı seperasyon; yüksek rezolüsyon; çok küçük numune hacmi gereksinimi ve işlem sırasında proteinin denatüre olmamasıdır. Dezavantajı ise proteinlerin tayini; miktarlarının saptanmasının güç olması ve proteinlerin kolona adsorbe olabilmesidir (23; 30).
2–200 µm (mikron) çapta ve 10–100 cm kadar uzunluktaki kapiller bir boru; bu borunun iki ucunda iki tampon haznesi; bu tampon haznelerinin birisine (+) birisine (-) kutbu bağlı olan bir güç kaynağı ve kapillerin bir ucunda mevcut bir dedektörden oluşur. Güç kaynağının iki kutbu arasındaki bağlantıyı kapiller borunun içini dolduran tampon sağlamaktadır (14; 22). Tampon katodun yönünde akar. Tampondaki anyonlar tampona karşı akışla anota gider. Numune katoda konulur. Kapilların iki ucu tampon içeren elektroforez hücrelerine daldırılır. Kapillar jel veya amfolit solüsyonları da içerebilir.
İmmunoelektroforez
Bazen jel üzerinde birbirinden ayrılmış proteinler; antikorlar adı verilen immunoglobülinlerle etkileşerek antijenik durumları hakkında bilgi sahibi olunur. Antijen-antikor reaksiyonu ile elektroforez yöntemini birlikte içeren bir tekniktir.
Serum proteinleri önce elektroforeze uğratılır; sonra bir jel ortamında antiserum ile karşılıklı diffüzyonu sağlanır. Oluşan antijen-antikor reaksiyonları sonucunda oluşan presipitasyonlar kavisler halinde belirir. Serum ve plazmada sayısı 150’den fazla olan proteinlerin 70 kadarını bu yöntemle ayırmak mümkün olmuştur (14; 21).
SERUM PROTEİNLERİ
Normal bir serum protein elektroforezi sonucunda; albümin; α1; α2; β ve γ-globülinden oluşmuş 5 temel fraksiyon elde edilmiştir (şekil 4). Sellüloz asetat elektroforezi ile elde edilen bu bantların sayısı hayvan türlerine göre değişir.
Şekil 4. Selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein bantları (31).
Bu bantların bileşimleri şöyledir;
- a. Prealbümin b. Albümin
- α1-globülinler
α1- asit glikoprotein
α1-lipoprotein
α1-fetoprotein
- α2- globülin fraksiyonu
Haptoglobülin
Serüloplazmin
4. Beta globülinler
β- lipoprotein
Transferrin
Kompleman proteinleri
β2- mikroglobülin
Hemopeksin
5. γ-globülinler (İmmunoglobülinler)
Ig A; Ig M; Ig G; Ig D; Ig
1. a) Prealbümin
Prealbümin; karaciğerde sentezlenir. Prealbümin molekülü üzerinde retinol bağlayan proteini bağlayacak yerler ve tiroksin bağlayabilecek bir yer bulunur. Oral kontraseptif kullananlarda; gebelerde; inflamatuar olaylarda; malign tümörlerde; malnütrisyonda; karaciğer hastalıklarında serum prealbümin düzeyi azalır (31).
1. b) Albümin
Serum albümin; karaciğerde sentezlenir. Renksiz; şekilsiz ve yumurta akı albüminine çok yakın bir maddedir. Serum albüminin önemli işlevleri vardır:
a) Bilirubin; uzun zincirli yağ asitleri; T3; T4; kortizol; aldosteron; Ca2+; Cu2+ ve bazı ilaçları taşır.
b) Endojen aminoasit deposu olarak görev görür.
c) Plazma onkotik basıncının devamlılığını sağlar.
d) Kanın viskozitesini etkiler. Serum albümin düzeyinin normal sınırlardan düşük olması hipoalbüminemiolarak tanımlanır. Serum albümin düzeyi 2;0 g/ dl’nin altına düştüğünde ödem gelişir (31).
2. a1-Globülin
a1-globülin fraksiyonunun önemli proteinleri:
● a1- antitripsin
● a1- antikimotripsin
● a1-asit glikoprotein (orosomukoid)
● a- fetoprotein (AFP)
a1-antitripsin; karaciğer parankim hücreleri; mononüklear seri hücreler ve alveoler makrofajlarda sentezlenir. Nadir olarak görülen kalıtımsal a1-antitripsin eksikliği; klinik olarak amfizem ve neonatal kolestatik sarılık ile karakterizedir. Alfa fetoprotein (AFP); fötusun ana proteinidir; karaciğerde sentezlenir. Hepatosellüler karsinom ve diğer karaciğer hastalıklarında; gebelikte; testis ve ovaryum kanserlerinde; mide kanserinde serum alfa fetoprotein (AFP) düzeyi artar.
3. a2-Globülin
a1 ve a2-globülinler arasında göç eden başlıca serum proteinleri; tiroksin bağlayan globülin ve seruloplazmindir. a2-globülin fraksiyonunun önemli proteinleri a2-makroglobülinve haptoglobindir. Tiroksin bağlayan globülin;bir glikoproteindir; tiroid hormonları olan T3 ve T4 için temel taşıyıcıdır. Seruloplazmin;daha çok a2-globülin fraksiyonunda gözlenen; %10 civarında karbonhidrat içeren bir bakırlı proteindir. Wilson hastalığında ve malnütrisyonda serum seruloplazmin düzeyi azalır. a2-makroglobülin; a2-globülin fraksiyonunun büyük çoğunluğunu oluşturur. a2-makroglobülin; plazmanın en önemli proteaz inhibitörlerinden biridir. Haptoglobin; karaciğerde sentezlenen ve eritrosit dışındaki serbest hemoglobini bağlayan plazma glikoproteinidir (31).
4. b-Globülin
b-globülin fraksiyonunun önemli proteinleri; hemopeksin ve transferrin (siderofilin)’dir (31).
5. g-GLOBÜLİN
g-globülin fraksiyonunun önemli proteinleri; immunoglobülinler (antikorlar); sistem proteini ve C-reaktif protein (CRP)’dir (31).
ELEKTROFOREZ KULLANIM ALANLARI
Elektroforez; proteinleri ayırmada kullanılan bir teknik olup serum; plazma; idrar; gözyaşı; dışkı; eklem sıvısı gibi organik ürünlere uygulanabilir. Kullanıldığı başlıca yerler;
- Serum veya plazma proteinlerinin sınıflandırılması;
- Protein miktarlarının tespiti;
- Proteinlerin yerinin tespiti;
- Anormal hemoglobinlerin tespiti;
- Bazı hastalıkların teşhisi;
- Taylarda kan grubu tayini
- Hastalığın safhalarının (akut; subakut; kronik) belirlenmesinde;
- Karaciğer-böbrek hastalıklarında ;
- Monoklonal globülin bozukluğunda (myelom) (31; 32).
Normalde bulunmayan bantların görünür hale gelmesi ise değişik klinik durumlarda gözlenmektedir. Albümin ile a1 bandı arasında belirecek soluk bir bant; bazı kötü huylu tümörlerde serumda artan a- fetoproteine bağlıdır. Monositer lösemilerde lizozim düzeyinin artışı γ bölgesinden ileride bir bant oluşturmaktadır. Protein kaybedilen nefropatilerde albümin; a1; β ve γ- globülinlerde azalma görülür (32).
Aktif hemoliz sonucu haptoglobülin eksikliği olan kişilerde a2 veya β bölgelerine göçen bağımsız bir hemoglobin bandı izlenmektedir. Demir eksikliği olgularında transferin artışına bağlı belirgin β bandı izlenmektedir. Bu yüzden myeloma bandı ile karışabilmektedir (32).
Karaciğer sirozu olgularında albümin sentezinin azalması ve kaybının artması sonucu serum konsantrasyonu azalmaktadır. Albümindeki azalma γ fraksiyonundaki immunglobülinlerin artışı ile dengelenmektedir. Tüm immunglobülinleri kapsayan γ globülin fraksiyonundaki artma ve yavaş β bölgesine uzanan IgA artışı; β-γ köprüleşmesi olarak adlandırılmaktadır (32).
Hipogamaglobülinemi γ bandının tamamına yakın veya tamamının yokluğudur. Lenforetiküler bozukluklarda ve kanser tedavisi için kemoterapi uygulanan vakalarda ve yeni doğanlarda rastlanır (32).
Akut ve kronik karaciğer hastalıkları; kronik enfeksiyonlar; akut diffüz glomerülonefrit; sarkoidoz; karsinom ve otoimmün hastalıklarda serum g-globülin fraksiyonu artar. Nefrotik sendrom; ağır malabsorpsiyon ve malnütrisyon; primer immun yetmezlik ve sekonder immun yetmezlik durumlarında serum g-globülin fraksiyonu azalır (31).
Şekil 5. Akut ve kronik inflamasyon durumunda selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları (31).
Karaciğer hastalıklarında özellikle β-globülin fraksiyonunda belirgin bir artış gözlenir. Sirozda serum albümin düşer; serum γ-globülin artışı hafiftir; a-globülin ve β-globülin konsantrasyonları serum lipoproteinindeki artışa bağlı olarak yükselmiştir (33).
Şekil 6. Siroz durumunda selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları (31).
Karaciğer paranşimal sentez