BABESİOSİSLİ KOYUNLARDA SERUM PROTEİNLERİNİN
ELEKTROFORETİK İNCELENMESİ

Veteriner Hekim Betül APAYDIN
BİYOKİMYA ANABİLİM DALI
YÜKSEK LİSANS TEZİ

DANIŞMAN
Doç. Dr. Semiha DEDE


Jüri Başkanı
TEZ KABUL TARİHİ

14/ 09/ 2006
Yüksek Lisans çalışmalarım sırasında beni yönlendiren; her türlü desteğini esirgemeyen; değerli danışmanım Sayın Doç. Dr. Semiha DEDE’ye; yüksek lisans eğitimimde benden yardımlarını esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Nihat MERT; Prof. Dr. Fatmagül YUR; Doç. Dr. Yeter DEĞER; Doç. Dr. Handan MERT ve Doç. Dr. Ali ERTEKİN’e ve araştırma görevlisi arkadaşlarıma; paraziter muayenedeki değerli yardımlarından dolayı sayın hocam Prof. Dr. Serdar DEĞER’e; elektroforetik analizlerdeki yardımlarından dolayı Prof. Dr. Ramazan ŞEKEROĞLU’na ve Biyokimya Teknikeri Metin YAŞAR’a; materyallerin sağlanmasında değerli yardımlarını esirgemeyen Veteriner Hekim Özay İLHAN’a ve son olarak beni yetiştiren ve benden her türlü desteklerini esirgemeyen annem; babam; ablam Özlem ve kardeşim Aydın’a teşekkürlerimi sunarım.

İÇİNDEKİLER
Kabul ve Onay …………………………………………………………...…….........
II
Teşekkür ...................................................................... ...............................................
III
İçindekiler …………………………………………………………………………..
IV
Simgeler ve Kısaltmalar …………………………………………………………….
VI
Şekiller ...................................................................... ................................…………..
VII
Tablolar ...................................................................... ................................................
IX
1.GİRİŞ ...................................................................... ................................................
1
2.GENEL BİLGİLER ...................................................................... ..........................
2
2.1.Babesiosis ...................................................................... ....................................
2
2.1.1. Tarihçe ...................................................................... .................................
3
2.1.2. Etiyoloji ...................................................................... ................................
3
2.1.3. Epidemiyoloji ...................................................................... .......................
4
2.1.4. Patogenez ...................................................................... ..............................
4
2.1.5. Semptomlar ……………................................................................. ............
5
2.1.6. Nekropsi ...................................................................... ...............................
6
2.1.7. Tanı………………………………………………………………………..
7
2.1.8. Tedavi ...................................................................... ...................................
7
2.1.9. Korunma ...................................................................... ...............................
8
2.2. Proteinler ...................................................................... ....................................
8
2.2.1. Protein Sınıfları ...................................................................... ....................
8
2.2.2. Serum Proteinleri ...................................................................... ..................
9
2.2.2.1. Prealbumin ...................................................................... ......................
10
2.2.2.2. Albumin ...................................................................... ...........................
10
2.2.2.3.a1-Globulin ...................................................................... .....................
11
2.2.2.4. a2-Globulin ……………………………………………………………
11
2.2.2.5. b-Globulin …………………………………………………………….
12
2.2.2.6. g-Globulin ……………………………………………………………..
12
2.2.3. Elektroforez ………………………………………………………………
13
2.2.4. Elektroforez Çeşitleri ……………………………………………………..
14
2.2.5. Elektroforez Kullanım Alanları …………………………………………...
17
2.2.6. Çeşitli Hastalıklarda Serum Protein Fraksiyonları……………………….
17
3. MATERYAL VE METOT ...................................................................... ...............
22
3.1. Materyal ...................................................................... .....................................
22
3.1.1. Hasta Materyali …………………………………………………………..
22
3.1.2. Kullanılan Alet ve Kimyasal Maddeler ………………………………….
23
3.2. Metot ………………………………………………………………………….
24
3.2.1. Selüloz Asetat Elektroforezi ile Serum Proteinlerinin Analizi ………….
24
3.2.2. Serum Protein Analizi (Biüret Metodu) …................................................
25
3.2.3. İstatistik Analiz ………………................................................................ .
27
4. BULGULAR ………................................................................... ...........................
28
5. TARTIŞMA VE SONUÇ ...................................................................... .................
38
ÖZET ...................................................................... ....................................................
44
SUMMARY ...................................................................... .........................................
45
KAYNAKLAR ...................................................................... .....................................
46
ÖZGEÇMİŞ ………………………………………………………………………….
51












SİMGELER VE KISALTMALAR
Alb : Albumin
A/G : Albumin/Globulin
α : Alfa
CuSO4 : Bakır sülfat
β : Beta
dl : Desilitre
ELİSA : Enzyme Linked Immun Assay
γ : Gama
g : Gram
IgA : İmmunglobulin A
IgD : İmmunglobulin D
IgE : İmmunglobulin E
IgG : İmmunglobulin G
IgM : İmmunglobulin M
im : İntra muskuler
kg : Kilogram
μm : Mikrometre
mg : Miligram
ml : Mililitre
M : Molar
Nm : Nanometre
N : Normal
PCR : Polymerase Chain Reaction (Polimer Zincir Reaksiyou)
KI : Potasyum iyodür
°C : Santigrat derece
SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulphate Polyacrylamide Gel Electrophoresis
NaOH : Sodyum hidroksit
NaCl : Sodyum klorür
SX : Standart sapma
sc : Subkutan
TP : Total Protein

ŞEKİLLER
Şekil 3. Selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları …………….
15
Şekil 4. Çeşitli hastalık durumunda selüloz asetat elektroforezi ile elde edilen protein fraksiyonları……………………………………………………………………

20
Şekil 5. Kontrol grubunda sellüloz asetat ile elde edilen elektroforezdeki protein fraksiyonları ……………………………………………………………………

31
Şekil 6. Kontrol grubunda sellüloz asetat ile elde edilen elektroforezdeki protein fraksiyonlarının dansitometrik görünümleri …………………………………..

31
Şekil 7. Hasta grupta sellüloz asetat ile elde edilen elektroforezdeki protein fraksiyonları…………………………………………………………………….

32
Şekil 8. Hasta grupta sellüloz asetat ile elde edilen elektroforezdeki protein fraksiyonlarının dansitometrik görünümleri …………………………………..

32
Şekil 9. Tedavi grubunda sellüloz asetat ile elde edilen elektroforezdeki protein fraksiyonları ……………………………………………………………………

33
Şekil 10. Tedavi grubunda sellüloz asetat ile elde edilen elektroforezdeki protein fraksiyonlarının dansitometrik görünümleri ………………………………......

33

Şekil 11. Kontrol grubu ile hasta ve tedavi sonrası gruptaki ortalama TP düzeylerinin karşılaştırılması ………………………………………………..

34

34

35

35

36

36

37


TABLOLAR
Tablo 6. Protein fraksiyonlarının % g’a çevrilmeleri sonucunda elde edilen değerler..
30


Kenelerin aktif olduğu yaz aylarında theileriosis; babesiosis ve anaplasmosis vakalarına ülkemizde sıklıkla rastlanılmaktadır. Bu hastalıklardan babesiosis bir protozoon hastalığı olmakla beraber tropik; subtropik ve hatta ılıman bölgelerde yaygın olarak görülür. Ülkemizde ise sığır; koyun ve keçilerde görülmekte ve büyük ekonomik kayıplara neden olmaktadır (1; 2).
Kandaki azotlu maddeler; organik ve inorganik N içeren bileşiklerden oluşur. Bunların içinde proteinler önemli yer tutarlar. Farklı çöktürme teknikleri ile kanda albumin; globulin; fibrinojen gibi proteinler saptanırken; elektroforetik tekniklerin gelişmesiyle 20’den fazla protein ayırt edildi. Böylelikle proteinlerin yapıları; hastalıklarla ilişkileri açıklandı (3).
Canlı hücrelerin önemli komponentleri olan proteinler; hidrolize olduklarında aminoasitlere parçalanırlar. Çok sayıda aminoasit yan yana dizilip bir birine peptid bağları ile bağlanırsa; zincir uzunluğu 100–1000 aminoasit tarafından teşkil edilen; molekül kütleleri 10.000’den 100.000’in üzerinde proteinler meydana gelir. “Protein” kelimesi; Berzelius tarafından kuruldu ve ilk defa (1840) Mulder’in kitabında kullanılarak; yunancada “ilk planda yer alırım” anlamına gelen; proteuo kelimesinden türetildi (4).
Elektroforez; yüklü partiküllerin bir elektrik akımının etkisi ile birbirlerinden ayrılması olayıdır (5). Bir iyonun göç hızı; tatbik edilen elektrik akımına; iyonun büyüklüğüne; şekline ve elektrik yüküne bağlıdır (6). Sıcaklık; pH; kullanılan tampon; akışkanlık; elektriksel alanın şiddeti; iyonik güç; sürtünme katsayısı; molekülün kimyasal yapısı; net yük; büyüklük ve akımın cinsi moleküllerin göç hızını etkiler (7).
Ülkemizde yaygın olarak bulunan kan parazitleri; tarıma dayalı ekonomi açısından önemli kayıplara yol açmaktadır. Bu çalışmada babesiosisli koyunlarda serum protein düzeyleri ve proteinlerin elektroforetik ayrımı yapılarak; albumin; α1; α2; β; γ-globulin ve bantlarının saptanması ve değişkenliği araştırıldı.

2. GENEL BİLGİLER
Ülkemizde çok yaygın olan paraziter hastalıklar ile ilgili pek çok yayın yapıldı. Türkiye ekonomisine büyük darbeler vuran bu hastalıklardan korunmak için tanı ve özellikle erken teşhis oldukça önemlidir. Yıllardır yoğun olarak devam eden hayvan hareketleri ve hüküm süren farklı iklim koşulları nedeniyle parazitlerin gelişimi için uygun bir ortam olan Türkiye’de; evcil hayvanlarda endoparazitlere bağlı olarak meydana gelen paraziter invazyonlara çok sık rastlanılmaktadır (8–10).
Sahip olduğu yüksek koyun populasyonu ile dünya ülkeleri arasında üst sıralarda yer alan ülkemiz için koyun yetiştiriciliği büyük ekonomik önem taşır. Paraziter invazyonlar koyun yetiştiriciliğinde et; süt; deri ve yapağı verimini düşürmekte; dolayısıyla ülke ekonomisi büyük zarar görmektedir (11).
Günümüzde paraziter hastalıkların erken teşhisinde rutin parazitolojik muayenelerin yanında; konakçının biyokimyasal yapısında meydana gelen bazı değişikliklerin tespiti ve serolojik testlerden yararlanılmaktadır.
2.1. Babesiosis
Kan emen kenelerle bulaştırılan ve Babesia türü protozoalar tarafından meydana getirilen bir protozoon hastalığıdır. Babesia soyu Piroplasmida dizisinin Babesidae ailesi içerisinde yer alan hücre içi parazitlerdir.Bütün Piroplasmida dizisindeki etkenlerin yaptıkları enfeksiyonlara piroplasmosis adı verilir. Sığırlarda yaşayan Piroplasma’ları ilk defa Babés’in keşfetmesinden dolayı; sebep oldukları enfeksiyonlara babesiosis adı verilir (12; 13).
Koyun ve keçilerin Babesidae enfeksiyonları dünyanın çeşitli bölgelerinde “carceag”; ictero-hematuria; “jaunise”; “koyunların malaryal kataral humması” ve “haemoglobinuria” gibi adlar alır. Türkiye’de halk arasında koyun ve keçilerin piroplasmosis ve babesiosis’ine “ağrı”; “ağrık”; “ağrıma”; “sıtma”; “kırça” denmektedir (13).
2.1.1. Tarihçe
Piroplasmida’lar ilk defa 1888 yılında Romanya sığırlarında Babés tarafından keşfedildi. 1892’de yine Babés; koyunlarda enzootik hemoglobinüriye sebep olan etkenlerin kenelerle nakledildiklerini buldu. Türkiye’de 1890’da Nicole ve Adil; sığır piroplasmaları üzerinde etütler yaptı. 1899’da Guglielmi; İtalya’da atlardaki Piroplasmaları keşfetti. 1900’de Ligniéres Arjantin’de aynı etkenleri buldu. Koch 1904’de; alyuvarlarda basil şeklinde parazitler gördü ve Piroplasma bigeminum’un genç şekilleri olarak kabul etti. Gonder; Nuttall; Graham; Sergent ve arkadaşları; Yakimoff ve arkadaşları bu etkenlerin sistem; biyoloji; bağışıklık ve tedavileri üzerinde çalışmalar yaptı. Sözü edilen bu etkenler Babesidae; Theileridae ve Anaplasmidae ailelerinde toplandı (14).
Babesia etkenleri koyun ve keçilerin alyuvarlarında bulunur. Piroplasma ovis’i Lestoquard; Cezayir’de: Dschunkowsky ve Luhs Kafkasya’da; Inchiostri; Dalmaçya’da tespit ettiler. Enigk (15); Almanya’da koyunlarda Babesia motasi ve Theileria recondita’yı tespit etti. P.ovis Güney Avrupa; Akdeniz ülkeleri; Afrika; Rusya; Asya ve diğer tropik ve subtropik bölgelerde rastlanmaktadır. Yurdumuzda Tüzdil (16); Özcan (17) ve Göksu (18) tarafından yapılan araştırmalara göre babesiosis yerli koyun ve keçilerde daha sık görüldü.
2.1.2. Etiyoloji
Babesiosis koyun ve keçilerde B.ovis ve B.motasi tarafından meydana getirilen; akut; subakut veya latent seyreden; mevsime bağlı protozoer bir hastalıktır. Babesiaların vektörleri 1; 2; 3 konakçılı kenelerdir. Bunlar Boophylus spp.; Hyalomma spp.; Rhipicephalus spp.;Haemophysalis spp.; Dermacentor spp. ve Ixodes spp.’dir. Ülkemizde B.ovis ve B.motasi’den ileri gelen babesiosis olguları Van ve yöresinde saptandı. B.ovis;1–1.5x2.5 μ büyüklükte; yuvarlak; oval veya armut şeklinde eritrosit içinde tek veya çift olarak bulunur. R.bursa; I.ricinus ve D.reticulatus başlıca vektörleridir. B.motasi; 2.5-5x 2.5 μ büyüklükte; daha çok eritrosit içinde armut formunda bulunur. Haemophysialis spp. ve Rhicephalus spp. türü keneler ile bulaşır (2; 12).
2.1.3. Epidemiyoloji
Hastalığın bulaşması ve insidensi kenelerin aktivitesiyle yakından ilgilidir. Keneler rutubetli ortamda ve 26–27 °C’de çok aktiftirler (2).
Genellikle koyun; keçi Babesidae enfeksiyonları her ırk ve her yaştaki hayvanlarda görülür. Fakat hastalık koyun ve keçilerde şiddetli; kuzu ve oğlaklarda hafif olarak görülür. Hastalık Orta Anadolu’da Haziran ve Temmuz aylarında enzootik bir durum gösterir. Koyunların babesiosisi Makedonya’da da aynı şekilde seyreder (19).
2.1.4. Patogenez
Babesialar kenelerde transovarial ve transtadial olarak nakledilir. Şekil 1’de belirtildiği gibi hasta veya latent enfekte hayvanların kanından alınan Babesia etkenleri; kenelerin sindirim kanalında serbest hale geçerek bağırsak epitellerine yerleşir ve çoğaldıktan sonra; karın boşluğuna dökülerek tükürük bezlerine ve ovaryumlara göç ederler. Ovaryumlarda bulunan yumurtalara geçerek nimfleri enfekte ederler. Tükürük bezleri yoluyla kan emerken sağlıklı koyun ve keçileri de enfekte ederler. Perifer kana ulaşan etkenler eritrositler içine yerleşerek ikiye bölünerek çoğalırlar ve eritrositleri hemolize ederler. Hemolize bağlı olarak şiddetli anemi; hemoglobinemi; hemoglobinüri ve ikterus oluşur. Hastalığın akut dönemini atlatan koyun ve keçilerde Babesialar hemapoetik organlara yerleşerek Babesia’ya has bağışıklık (premunite) oluşumuna neden olurlar. Premunite gelişmiş hayvanların eritrositlerinde tek tük Babesia saptanabilir (12; 20).
Enfeksiyonu geçirenler bağışıklık kazandığı için; endemik bölgelerde özellikle kuzu ve oğlaklar kolostrumla yeterince antikor alırlarsa enfeksiyona dayanıklı olurlar. Enfeksiyonu alsalar bile çok hafif atlatarak aktif bağışıklık kazanırlar. Bu bağışıklık eğer enfeksiyon nükseder ise kalıcı olur. Başlangıçta etkili bir sağaltım uygulanmış